引言

朊病毒是一类能够引起人类和动物脑部蛋白质异常折叠的传染性病原体。这种感染通常会造成脑损伤，并且常常致命。相关的神经退行性疾病实例包括羊瘙痒症、疯牛病（牛海绵状脑病）和克雅氏病。以往，研究朊病毒需要进行长时间的生物测定，通常对受感染动物进行为期1至6个月的观察，这种方法不仅耗时，而且饲养感染动物的成本也很高。位于蒙大拿州汉密尔顿的落基山实验室研发了一种新的朊病毒检测技术，称为实时震荡诱导转化测定法（RT-QuIC），该方法可定量评估感染样本中的朊病毒水平。与传统检测方法相比，RT-QuIC检测的速度更快，通量更高。仅需20小时，该测定就能完成，灵敏度与全动物模型相当，甚至更优。BMGLABTECH的FLUOstarOmega酶标仪以其坚固的“德国制造”结构，独具长时间震荡和培养微孔板的能力。RT-QuIC测定每15分钟进行一次测量，持续20-68小时，期间交替震荡1分钟和静置1分钟。我们开发的脚本用于自动控制激活测定所需的震荡和静置时间。

检测原理

RT-QuIC检测法用于估算朊病毒接种的相对数量。该方法通过对样本进行连续稀释，并统计估算接种剂量（SD）。实验中，少量传染性朊病毒被加入正常的朊病毒蛋白中，从而诱导其发生类似疾病的错误折叠。量化通过测量样本的稀释度并确定接种活性损失（SD50）来进行，即最终的稀释度。

实验步骤

实验持续20-68小时，仪器设定在42°C恒温孵育。我们编写了两个测定协议的脚本。第一个协议设定为每分钟振荡一次、然后静置一分钟；第二个协议则是在每15分钟间隔使用底部光学镜进行荧光终点测量。荧光染料硫黄素T（ThT）用作朊病毒接种标记。在重组的朊病毒蛋白中加入ThT，当发生聚合反应时，ThT与朊病毒蛋白结合，荧光随时间增加。

仪器设置

各项设置如荧光终点测量、底部读数、激励滤光片450纳米、排放滤光片480纳米、闪光灯强度2000、震荡速率700RPM双轨道均已调试完毕。分析采用斯皮尔曼-凯伯（Spearman-Kärber）分析法，类似于生物测定的50%致死剂量（LD50），用于估算每克组织中50%的孔产生ThT阳性反应的播种剂量或稀释倍数（SD50/g）。

结果与讨论

通过软件脚本对RT-QuIC检测进行了20至68小时的测量，数据来自8个重复孔的相对荧光单位平均值。除了线性振荡和轨道振荡外，