细胞凋亡是一个复杂的生理过程，通常伴随着显著的细胞形态变化。在凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转到细胞膜表面，而在凋亡的中后期，随着细胞膜通透性增加，一些较大的分子，如碘化丙啶（PI），会自由进入细胞，染色细胞核，使其呈现红色荧光。

Annexin V/PI 检测原理

Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能够与PS高亲和力特异性结合。由于其无法透过完整的细胞膜，因此早期凋亡的细胞通常膜完整，对PI呈现拒染性。然而，在凋亡中晚期的细胞和死亡细胞中，PI能够穿透细胞膜，使细胞核被染成红色。因此，使用Annexin V和PI组合，可以有效区分早期凋亡细胞和其他细胞。

Annexin V/PI 凋亡检测推荐（尊龙凯时）

[名称] 流式细胞凋亡检测试剂盒

[货号] AC12L033

[规格] 100T

操作步骤

1. 对照管设置

空白管：不加染料的诱导凋亡细胞，用于调节电压。

单染管：分别添加PI和荧光标记的Annexin V的单染管用于调节补偿。

实验管：诱导凋亡的细胞添加本次实验所有荧光染料。

阴性管：正常培养细胞添加染料，用以确认细胞正常状态并排除假阳性。

2. 悬浮细胞收集染色

在完成细胞凋亡刺激后，离心5分钟，去除上清，收集细胞并用PBS轻轻重悬并计数。取1~5×10⁵重悬的细胞，离心5分钟后去除上清，加入500µl结合液并轻轻重悬细胞。添加5µl的Annexin V-FITC并轻轻混匀，然后再添加5µl碘化丙啶，再次轻轻混匀。室温避光孵育10分钟，可用铝箔遮光。随后进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC显示绿色荧光，PI显示红色荧光。

3. 贴壁细胞收集染色

吸走细胞培养液至合适的离心管中，PBS洗涤贴壁细胞一次，使用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞。细胞消化后按照悬浮细胞的操作步骤进行。

4. 上机检测

染色孵育后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

Annexin V/PI 检测法注意事项

• 在处理贴壁细胞时，若难以控制消化时间，建议使用Accutase细胞消化液，以减少对细胞的损伤，同时保持细胞膜上PS的分布。

• 选择Annexin V的荧光染料时，需考虑细胞的自发荧光，尤其对经过长时间培养或药物处理的细胞，确保细胞代谢物或药物本身的荧光不会干扰FITC/PE，一般推荐使用Annexin V-APC。

• 完成细胞染色后不可固定，需尽快进行检测，可将检测管放在冰上，以减少外界环境对结果的影响。

• 在进行凋亡统计时，通常关注前凋亡细胞的比例，因为仅有前凋亡细胞的统计结果才有意义，尽管也有文献分析总的凋亡比例（前凋亡与晚期凋亡之和），但单纯统计晚期凋亡的比例则不具太大意义。

如您对细胞凋亡的研究有任何疑问，欢迎咨询尊龙凯时，我们将竭诚为您提供支持和指导。