**破骨细胞诱导分化机制** 破骨细胞是源自造血干细胞分化而来的特有多核细胞，专门负责骨吸收。RANKL/RANK/OPG信号通路是调节破骨细胞分化的核心机制，精确控制破骨细胞与成骨细胞活性之间的平衡，从而维持骨骼稳态。根据研究，核因子κB受体激活因子配体（RANKL）是促进破骨细胞成熟与其功能活性的关键因子。通过M-CSF刺激，可使破骨细胞前体在细胞膜上表达RANK，进而与RANKL结合，诱导其分化为破骨细胞。由于破骨细胞在体内数量稀少，仅占分离细胞的0.8%-1.2%，且在体外分离培养困难，通常采用诱导法进行破骨细胞生成，其中最常用的方法是骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

**骨髓单核细胞诱导法** 选取8-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，采用CO2吸入法处理后，用75%乙醇进行消毒。无菌条件下完整取下小鼠后肢，清除多余的皮肤与肌肉，随后将骨骼置于含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液中。从胫骨和股骨分离骨髓，并用相同PBS溶液清洗两遍，以保证无菌操作，防止污染。然后用注射器注入α-MEM，冲洗骨髓细胞，过滤至离心管中。接着进行室温离心，处理红细胞，然后用培养基重悬细胞，并转移至培养皿中培养。在细胞达到融合的80%-90%时，接种至24孔板中，其中加入M-CSF和RANKL以诱导破骨细胞分化，最后经过TRAP染色法观察并确认破骨细胞的形成。

**RAW264.7细胞系诱导法** RAW264.7细胞在含10%FBS的DMEM中进行常规培养，每隔一天更换培养基。当细胞达到80%-90%融合时，轻轻收集并进行传代。在含10%FBS的α-MEM培养基中，将RAW264.7细胞制成细胞悬液并接种于24孔板中。12小时后，加入RANKL进行诱导。每3天更换一次培养基，并补加RANKL。多核破骨细胞将在4天后开始出现，并逐渐增多，最后进行TRAP染色以进行破骨细胞鉴定。

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